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Dernière mise à jour : Mai 2018

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BIOGER

BIOlogie et GEstion des Risques en agriculture - Champignons Pathogènes des Plantes

Soutenance de thèse - 25 novembre

Soutenance de thèse - 25 novembre
Colin Clairet - "Contrôle chromatinien et transcriptionnel de l'expression des gènes codant des effecteurs chez Leptosphaeria maculans, champignon pathogène du colza."

Colin Clairet soutiendra sa thèse le 25 novembre 2019 à 13h30 à l'INRA BIOGER (1 Avenue Lucien Brétignière 78850, Thiverval-Grignon.)

L'intitulé de son sujet est: "Contrôle chromatinien et transcriptionnel de l'expression des gènes codant des effecteurs chez Leptosphaeria maculans, champignon pathogène du colza."

Résumé:Leptosphaeria maculans est un champignon pathogène, responsable de la nécrose du collet du colza (Brassica napus). L. maculans présente un cycle de vie complexe où se succèdent des phases biotrophes et nécrotrophes. De plus il possède un génome bipartite alternant régions riches en gènes (isochores GC) et régions riches en élément transposable et en gènes codant des effecteurs exprimés pendant les étapes précoces de l’infection (isochores AT). Très peu de connaissances sont disponibles concernant la façon dont l’expression des effecteurs est contrôlée. Une précédente étude avait établi que l’expression d’au moins deux gènes codant des effecteurs étaient sous contrôle d’une modification chromatinienne via la mise en place de la marque répressive H3K9me3 par l’histone méthyltransférase KMT1, in vitro. Au cours de l’infection, ce contrôle serait levé permettant l’action de facteurs de transcription (FTs) spécifiques.

L’objectif de ma thèse était d’étudier l’influence d’un contrôle chromatinien et transcriptionnel sur l’expression génique et de déterminer le rôle de protéines modificatrices d’histone (HMEs) ainsi que de FTs dans le contrôle de l’expression des gènes codant des effecteurs. Pour cela, deux approches ont été développées: (i) une approche «genome-wide» combinant analyse du positionnement des nucléosomes (MAINE-Seq), de la répartition de marques hétérochromatiniennes et euchromatiniennes le (ChIP-Seq) et analyses transcriptomiques (RNA-Seq) chez L. maculans et une espèce fongique proche, non pathogène du colza et (ii) une approche fonctionnelle basée sur l’inactivation par CRISPR-Cas9 de gènes codant des FTs et des HMEs afin d’étudier l’impact de ces inactivations sur la croissance, la pathogénie et l’expression génique.

Grâce aux analyses de MAINE-Seq, nous avons pu établir pour la première fois une carte de positionnement des nucléosomes chez quatre espèces phytopathogènes, dont L. maculans. Nous avons également construit une carte de modifications chromatiniennes le long du génome de deux espèces très proches au sein du complexe d’espèces de L. maculans. Nous avons établi que les isochores AT sont largement enrichis en marque hétérochromatinienne H3K9me3 alors que les isochores GC sont enrichis en marque euchromatinienne H3K4me2 et en marque hétérochromatinienne H3K27me3.

La HME KMT1, et LmPf2, un FT ayant un profil d’expression similaire à celui des effecteurs et décrit chez plusieurs espèces de Pleosporales comme contrôlant l’expression de toxines et d’effecteurs, ont été inactivés chez L. maculans. Nous avons également réalisé une surexpression de LmPf2 dans une souche ∆kmt1 dans laquelle la chromatine est décondensée et dans une souche sauvage de L. maculans. Ces expériences nous ont permis de déterminer que LmPf2 contrôle l’expression des effecteurs AvrLm dans un contexte où la chromatine est ouverte (∆kmt1). Il s’agit du premier exemple d’un double contrôle de l’expression de gènes codant des effecteurs par une HME et un FT.

Enfin, j’ai pu initier l’étude de l’implication de KMT1 et KMT6, la protéine responsable du dépôt de la marque répressive H3K27me3, dans l’expression des gènes codant des effecteurs. Pour cela j’ai généré les mutants ∆kmt1, ∆kmt6, et double mutant ∆kmt1_∆kmt6 et initié leur caractérisation. J’ai par ailleurs généré du matériel pour des analyses de ChIP-Seq, RNA-Seq et Hi-C-Seq qui nous renseigneront sur l’impact des marques répressives H3K9me3 et H3K27me3 sur la structure du génome, l’organisation au sein des noyaux et l’expression génique.

En conclusion, le travail réalisé au cours de cette thèse nous a permis de comprendre l’implication de la structure de la chromatine et de FTs dans l’expression des effecteurs précoces en condition de vie axénique.

 

Summary:Leptosphaeria maculans is a pathogenic fungus responsible for the stem canker of oilseed rape (Brassica napus). L. maculans exhibits a complex life cycle with successive biotrophic and necrotrophic phases. In addition, it has a bipartite genome alternating gene-rich regions (GC isochores) and regions enriched in transposable elements and in effector-encoding genes expressed during the early stages of infection (AT isochores). Very little is known on how the expression of effectors genes is controlled. A previous study had established that the expression of at least two effector-encoding genes was repressed by a chromatin-based control involving the repressive mark H3K9me3 deposited by the histone methyltransferase KMT1, in vitro. During infection, this control was postulated to be lifted allowing the action of specific transcription factors (TFs).

The objective of my thesis was to study the influence of chromatin and transcriptional control on gene expression and to determine the role of histone modifying proteins (HMEs) and TFs in the control of effector-encoding gene expression. To this end, two approaches have been developed: (i) a "genome-wide" approach combining analysis of nucleosome positioning (MAINE-Seq), distribution of heterochromatin and euchromatinin modifications (ChIP-Seq) and transcriptomic analyses (RNA-Seq) in L. maculans and a closely related fungal species not pathogenic of oilseed rape and (ii) a functional approach based on the inactivation by CRISPR-Cas9 of TFs-encoding genes and HMEs to study the impact of these inactivations on growth, pathogenicity and gene expression.

MAINE-Seq analysesallowed us establishing for the first time a nucleosome positioning map in four phytopathogenic species, including L. maculans. We also determined a chromatin modification map along the genome of two closely related species within the L. maculans species complex. We established that the AT isochores are largely enriched in the heterochromatin mark H3K9me3 while the GC isochores are enriched in the Euchromatin mark H3K4me2 and the heterochromatin mark H3K27me3.

The genes encoding the HME KMT1 and LmPf2, a TF with an expression profile similar to that of effectors genes and described in several Pleosporales species as controlling the expression of toxins and effectors, have been inactivated in L. maculans. We also overexpressed LmPf2 in a ∆kmt1 mutant in which the chromatin is decondensed and in a wild type strain of L. maculans. These experiments allowed us to determine that LmPf2 controls the expression of effector waves in a context where the chromatin is open. This is the first example of a double control of the expression of effector-encoding genes by an HME and a specific TF.

Finally, I initiated a study of the involvement of KMT1 and KMT6, the protein responsible for the deposition of the repressive modification H3K27me3, in the control of effector-encoding gene expression. For this purpose, I generated mutants ∆kmt1, ∆kmt6, and a double mutant ∆kmt1_∆kmt6 and initiated their characterization. I also generated material for ChIP-Seq, RNA-Seq and Hi-C-Seq analyses that will inform us about the impact of the repressive marks H3K9me3 and H3K27me3 on genome structure, organization within nuclei and gene expression.

In conclusion, the work carried out during this thesis has allowed us to better understand the involvement of chromatin structure and TFs in the control of effector gene expression.